Entreteses

O Platô São Paulo, planalto da costa marítima brasileira pertencente às regiões mais profundas das Bacias de Campos e Santos, abriga micro-organismos que aos poucos se revelam uma riqueza enorme aos cientistas. Local conhecido pela exploração sistemática de petróleo e derivados, também é lar de bactérias capazes de biodegradar e bioemulsificar o n-hexadecano (C16H34), um dos hidrocarbonetos componentes do óleo bruto. A recente descoberta foi feita por Cindi Espada de Souza, mestre em Ciência e Tecnologia da Sustentabilidade pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

Seu trabalho, orientado por Suzan Pantaroto de Vasconcellos e co-orientado por Cristina Rossi Nakayama, ambas docentes do Instituto de Ciências Ambientais Químicas e Farmacêuticas (ICAQF/Unifesp) - Campus Diadema, traz à tona investigações de habitats ainda pouco explorados, como os asphalt seeps (vazamento de asfalto), vazamentos naturais de óleo através dos afloramentos de rochas no fundo oceânico. Diferentemente dos derramamentos de óleo provocados por atividades humanas (tais como transporte e exploração de reservatórios), as expulsões naturais liberam petróleo lentamente ao longo do tempo, permitindo que os ecossistemas se adequem.

Nesse sentido, outra questão que deixou as pesquisadoras intrigadas foi a presença e a adaptabilidade de bactérias, comumente encontradas em regiões quentes do globo, em condições de exposição ao hidrocarboneto como fonte única de carbono sob baixas temperaturas (2,5ºC). O gênero bacteriano Bacillus sp., avaliado em laboratório, revelou taxas de biodegradação do n-hexadecano acima de 50%. Já outros dois isolados obtidos pelo estudo, Bacillus pumilus e Klebsiella sp (amplamente encontrado no trato digestivo humano), destacaram-se pela atividade emulsificante acima de 50% de diferentes compostos graxos.

Mais desconhecido que o solo lunar

Região sudeste da costa brasileira foi escolhida pelos pesquisadores como ponto de partida para o estudo, por abrigar as bacias de Santos e Campos (Divulgação/Agência Fapesp)

Foram raras as vezes que regiões mais remotas, frias e inexploradas do oceano puderam ser acessadas. Apesar de o mar profundo representar 75% do volume total dos oceanos e o assoalho oceânico ocupar 65% da superfície terrestre, conhecemos menos de 10% dessas regiões em profundidades acima de 200 metros. "Há 50 anos, o fundo oceânico era considerado um ambiente plano, uniforme e biologicamente pobre. Com o avanço nas pesquisas, hoje conhecemos regiões de grande riqueza e abundância de vida, como planícies abissais que abrigam milhões de bactérias ativas por grama de sedimento. Desde então, os esforços para conhecer as regiões profundas dos oceanos têm se intensificado, com o desenvolvimento de tecnologia capaz de superar as dificuldades de se estudar esse ambiente tão remoto e extremo. Tomo como exemplo o projeto Busca pelos Limites da Vida, executado em 2013 pela Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia da Terra e do Mar (Jamstec) em parceria com a Universidade de São Paulo (USP) e a Companhia de Pesquisa de Recursos Minerais (CPRM)”, conta Nakayama.

Na época, a Jamstec e o Instituto Oceanográfico (IO/USP) enviaram cientistas brasileiros, chineses e japoneses para regiões do Atlântico Sul, a bordo do navio R/V Yokosuka equipado com o submersível Shinkai 6500, com a finalidade de visitar ambientes de águas profundas e observar a estratégia adaptativa de organismos submetidos a alta pressão e temperaturas que variam entre -1°C e 4°C. “Resultou do convênio o cruzeiro IatáPiuna (termo tupi-guarani que significa ‘navegando por águas profundas e escuras’), com viagens na costa sul-sudeste brasileira e participação de pesquisadores de diferentes instituições de pesquisa, entre elas a Unifesp”, conta Nakayama.

A bordo do submersível com capacidade para um cientista e dois pilotos, Nakayama participou da segunda "pernada" (assim chamada a sequência de mergulhos realizada pelo submarino). “A primeira ocorreu na Elevação do Rio Grande e na Dorsal São Paulo, formações rochosas submarinas localizadas no Atlântico Sul, e a segunda no Platô São Paulo, na mesma região”, conta. Inicialmente em busca de vazamentos naturais de gás metano, a docente da Unifesp foi surpreendida ao presenciar a formação de um oil seep em seu estágio inicial.

Ela comenta que a diversidade e a abundância de seres vivos são mais expressivas nas regiões de escapes naturais de óleo, atualmente consideradas verdadeiros oásis por abrigarem concentrações de biomassa em ordens de grandeza acima das observadas nas planícies abissais. O material orgânico não assimilado rapidamente pela fauna presente na interface água-sedimento torna- -se normalmente alimento às bactérias do sedimento. Essas, desempenhando o seu papel no ciclo global do carbono, decompõem os hidrocarbonetos presentes no óleo, liberando compostos que podem ser utilizados pela fauna marinha profunda, regulando recursos alimentares de acordo com as suas taxas de transformação. Portanto, têm papel fundamental na reciclagem dos nutrientes, favorecendo o desenvolvimento de uma fauna mais rica no fundo oceânico.

Em sua participação no cruzeiro IatáPiuna, a pesquisadora teve a oportunidade de coletar rochas, óleo e sedimentos em uma área de asphalt seep localizada cerca de 260 km do litoral do Estado do Espírito Santo e a profundidades entre 2.650 - 2.750 m, para posteriores análises, realizadas no Laboratório Multidisciplinar em Saúde e Meio Ambiente do ICAQF/Unifesp. Obtidas a partir da expedição realizada de 10 a 24 de maio de 2013, as amostras continham bactérias comuns na superfície do fundo oceânico e em uma profundidade de até 10 cm abaixo dele, o que permitiu uma gama de estudos englobando aspectos taxonômicos, filogenéticos, biogeográficos e moleculares pela então mestranda Souza.

Cristina Rossi Nakayama, pesquisadora do Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas (ICAQF/ Unifesp), foi surpreendida durante suas expedições por oil seeps, vazamentos de petróleo submersos, em seus estágios iniciais (Divulgação/Agência Fapesp)

Cristina Rossi Nakayama, pesquisadora do Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas (ICAQF/Unifesp), foi surpreendida durante suas expedições por oil seeps, vazamentos de petróleo submersos, em seus estágios iniciais (Divulgação/Agência Fapesp)

A união fez a força

Com as amostras em mãos, Souza desenvolveu sua pesquisa organizando todo esse material em uma coleção de 162 isolados bacterianos, divididos de acordo com fatores como profundidade em que foram encontrados, condições de cultivo, habilidades e mesmo a possibilidade dessas bactérias agirem mais eficazmente em conjunto. "Quando coloquei esses micro-organismos em meios de cultura, utilizei o conceito de consórcio, uma técnica aplicada para verificar se sua ação é mais efetiva trabalhando em conjunto de modo a beneficiar todos os gêneros bacterianos envolvidos. Futuramente pretendo avaliar o desempenho isolado dessas bactérias de acordo com sua estratificação de origem", afirma.

Tais isolados foram submetidos a procedimentos envolvendo técnicas de triagem rápida para a verificação da habilidade de sobrevivência em condições de exposição ao hidrocarboneto n-hexadecano como fonte única de carbono. Nesse quesito, foi possível a seleção de 51 bactérias, também avaliadas quanto à produção de metabólitos com atividade emulsificante quando utilizado óleo de motor automotivo como composto graxo.

Três isolados (Csh 01, Csh 26 e Csh 28A) revelaram uma média de biodegradação do hidrocarboneto acima de 50%, revelando o desempenho destacado de bactérias pertencentes ao gênero Bacillus sp., com maior proximidade filogenética à espécie Bacillus cereus. Dois isolados foram selecionados quanto à atividade bioemulsificante acima de 50% (Csh 31 e Csh 32B), identificados posteriormente como pertencentes às espécies Klebsiella oxytoca (Csh31) e Bacillus pumilus (Csh 32B).

As análises da atividade de biodegradação do hidrocarboneto pela bactéria somente foram possíveis, segundo Souza, devido à aplicação de duas técnicas amplamente utilizadas nesses casos, a técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CGEM). A primeira trata-se de um processo para análise de misturas usada em química orgânica para separação de compostos que podem ser vaporizados sem decomposição, enquanto que a segunda diz respeito à técnica analítica para detectar e identificar moléculas de interesse por meio da medição de massa baseando-se nos íons que compõem a molécula, permitindo a elucidação estrutural de diferentes compostos orgânicos.

Resultados promissores a altas temperaturas

Durante 28 dias, Souza e sua orientadora acompanharam o desempenho dos isolados periodicamente, coletando pequenas amostras laboratoriais após intervalos de 24 e 72 horas, e depois após 7, 14, 21 e 28 dias. Como sobreviveram a baixas temperaturas, mas se mantiveram fisiologicamente ativas em ambientes quentes, essas culturas bacterianas foram avaliadas à temperatura de 30°C. Após analisar todos os cromatogramas, Souza obteve os índices de biodegradação em cada tempo amostral.

 No caso do isolado Csh 01, seu desempenho chegou à capacidade máxima (100%) logo após o primeiro dia, mantendo-se constante até o último dia do experimento. No caso do Csh 26, a capacidade de biodegradação logo após o primeiro dia ficou em torno de 80%, também constante até o final dos 28 dias. Já o isolado Csh 28 "esquentou os motores" da biodegradação somente após sete dias de monitoramento, alcançando a capacidade de aproximadamente 90% no 21° dia e diminuindo suas atividades para a taxa de 80% no 28° dia. Já os isolados Csh 31 e Csh 32B apresentaram desempenho biodegradador quase nulo, entretanto mostraram habilidades bioemulsificantes.

Souza reforça que, apesar de os componentes resultantes da biodecomposição de hidrocarbonetos ser predominantemente gás carbônico, o pH de todas as amostras manteve-se estável desde o início, começando e terminando em uma faixa de valores variantes entre 7 e 8, o que descarta a acidificação das águas oceânicas em uma aplicação em larga escala dessas bactérias para biorremediação. "De acordo com a Resolução Conama 357/2005, pHs entre 7,3 e 8,3 apresentam-se dentro da normalidade para água salina", discorre em seu trabalho. "Sendo as linhagens de origem marinha, houve uma adaptação e produção efetiva, pois o Ph está intimamente relacionado à produtividade microbiológica".

Apesar de  mar profundo ser composto por 75% de todo seu volume de água, e o assoalho oceânico por sua vez ocupar 65% da superfície terrestre, conhecemos menos de 10% dessas regiões além dos 200 metros de profundidade (Organização Nacional Francesa de Hidrografia/2016) / (Imagem: Geoffrey Whiteway/Freepik)

Coleta de amostras de oil seeps no fundo oceânico do Platô São Paulo

Caracterização molecular

O avanço das técnicas de Biologia Molecular, associado aos novos procedimentos de Bioinformática, tem possibilitado que micro-organismos diversos presentes em áreas impactadas sejam detectados e classificados. Dessa forma, a Biologia Molecular torna-se uma poderosa ferramenta para o monitoramento de estudos de impactos ambientais. O desenvolvimento in situ e in vitro de linhagens provindas de sedimentos e diversos biomas, passam não somente a ter como objetivo o isolamento e a identificação de espécies com potencial de biodegradação, mas também a aferição dos efeitos metabólicos e substanciais sobre sua aplicabilidade em locais impactados.

Diante da capacidade comprovada dos isolados selecionados à biodegradação do hexadecano (Csh 01, Csh 26 e Csh 28A) e produção de bioemulsificantes (Csh 31 e Csh 32B), partiu-se às análises para a caracterização filogenética de tais bactérias, realizadas em colaboração com a equipe do Laboratório Alerta da Escola Paulista de Medicina (EPM/Unifesp) - Campus São Paulo, espaço desenvolvido para projetos de pesquisa de investigação de mecanismos moleculares de resistência bacteriana a antimicrobianos, sob a orientação de Rodrigo Cayô da Silva.

Por meio do sequenciamento do gene rRna 16s, os três isolados com potencial ação biodegradadora foram identificados como predominantemente pertencentes ao gênero Bacillus sp. Já as outras duas culturas marcadas pela atividade exclusivamente bioemulsificante foram afiliadas às espécies Klebsiella oxytoca e Bacillus pumillus.

A despoluição como perspectiva

Posto que as bactérias são potenciais agentes de biorremediação dos mares nos casos de vazamento de petróleo, como ocorreria sua aplicação em larga escala em biorremediação? Questionadas, as três pesquisadoras são realistas. "Esse hidrocarboneto é um alcano, com uma estrutura molecular formada por 16 carbonos sequenciais e, na rota de biodegradação e bioemulsificação, é um dos primeiros a serem atacados por qualquer bactéria que tenha habilidade biodegradadora. Em razão disso, é utilizado como composto modelo para encontrar

micro-organismos potenciais para esse tipo de atividade. O fato de a Bacillus sp., da Klebsiella oxytoca e da Bacillus pumilus terem afinidade pelo consumo de n-hexadecano potencializa sua aplicação ambiental, mas não que isso garanta condições de ocorrer de fato - ao menos no momento”.

Uma alternativa viável, pontua Vasconcellos, seria aplicar apenas as enzimas ou produtos microbianos em processos que almejem biorremediação ou destoxificação de águas prejudicadas, afirma. Nakayama ressalta que um dos principais empecilhos para o uso dessas bactérias nesse tipo de atividade se dá pela legislação ambiental vigente no Brasil. "Aqui é preciso uma licença que garanta que essas bactérias estejam em seu estado mais inerte possível, pois a aplicação de micro-organismos exógenos, em tese, pode gerar competição, levando a problemas maiores, como a alteração completa da microbiota local", finaliza.