Entreteses

O fungo é um microrganismo que age como parasita de outros seres, vivos ou mortos, dos quais se alimenta. Existem fungos prejudiciais à saúde, que causam doenças (micoses, meningites fúngicas e aspergilose, entre outras); há os que exploram vegetais e animais mortos e os que servem como alimento adequado ao consumo humano – como alguns tipos de cogumelos –, finalmente, há os que servem como matéria-prima para a produção de medicamentos importantes, como a penicilina. Ele se apresenta em formas microscópicas (como bolores e leveduras) ou de cogumelos. O fungo tem algumas características próprias que o diferencia das plantas: não sintetiza clorofila, não possue celulose na sua parede celular e, por fim, não armazena amido como substância de reserva.

A complexidade e variedade funcional de um fungo suscitam muitos estudos, tendo como objeto o seu potencial biotecnológico, as eventuais doenças que causa e possíveis antifúngicos que podem ser criados a partir de sua biologia. Esse estudo é feito por professores da Unifesp, que atualmente desenvolvem quatro diferentes pesquisas na área.

Doenças Fúngicas

No mundo, mais de 300 milhões de pessoas de todas as idades sofrem de uma infecção fúngica grave a cada ano. Destas, mais de 1.350.000 irão morrer. As infecções causadas por fungos podem ser divididas em cinco grupos: as invasivas, que muitas vezes são fatais, meningite fúngica ou criptococose (600 mil mortes por ano), pneumonia por Pneumocystis (80 mil mortes), histoplasmose, aspergilose (100 mil mortes), infecção de corrente sanguínea por Candida (120 mil mortes); as de pele, cabelos e unhas (micose, pé de atleta, candidíase oral e esofágica); alérgica (aspergilose broncopulmonar alérgica) e pulmonar crônica ou infecção de tecidos profundos (aspergilose pulmonar crônica – 450.000 mortes), além das micoses endêmicas. Os dados foram coligidos por duas entidades internacionais não governamentais, Gaffi (Global Action Fund For Fungal Infections – Fundo de Ação Global para Infecções Fúngicas) e Life (Leading International Fungal Education – Dirigindo a Educação Internacional sobre Fungos). Elas são complementares: a Life visa, basicamente, promover programas de educação continuada na área das infecções fúngicas, além de estratégias para o desenvolvimento de projetos para diagnóstico e tratamento dessas enfermidades. O Gaffi angaria recursos e investe nas estratégias que a Life propõe.

Arnaldo Colombo: médico e pesquisador

O médico, pesquisador e professor titular da Escola Paulista de Medicina (EPM)da Unifesp – Campus São Paulo, Arnaldo Colombo, faz parte do conselho técnico das duas entidades (Gaffi e Life), representando a América Latina. Ele também é diretor técnico do Laboratório Especial de Micologia da Unifesp, que é referência nacional há mais de 20 anos no combate à mortalidade por doenças fúngicas. O local recebe recursos públicos do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp).

O laboratório desenvolve três linhas de trabalho. A primeira discorre sobre a epidemiologia das infecções: quais são as populações suscetíveis, quais as taxas e densidades de ocorrência, a incidência em hospitais terciários, o impacto em termo de morbidade/mortalidade, as espécies envolvidas e o perfil de sensibilidade das espécies que causam as infecções a drogas antifúngicas. A segunda trabalha com a micologia convencional e molecular, ajudando os centros médicos a fazer o diagnóstico precoce das doenças. A terceira linha tem como foco a  participação em redes nacionais e internacionais, com a intenção de fazer a vigilância de espécies emergentes e de resistência antifúngica.

Conforme descreve o médico responsável, a falta de conhecimento é agravada pela péssima estrutura tanto no diagnóstico quanto no tratamento das infecções. “Nos currículos médicos há pouca carga horária dedicada a discutir a micologia médica, resultando em poucas pessoas capacitadas. Somando à negligência e à falta de entendimento do Sistema Único de Saúde (SUS) e dos seus profissionais, não são feitos exames. Desse modo, há desinteresse comercial para o desenvolvimento de testes diagnósticos e de drogas antifúngicas”. Até há pouco, existiam apenas três antifúngicos no mercado: Anfotericina B, Fluconazol e Itraconazol, comparados com os mais de cem sais de antibiótico. Ao longo do desenvolvimento tecnológico que se  seguiu à pandemia da Aids, houve também um aporte de recursos para tratar as infecções decorrentes, entre elas as causadas por fungos.

Gaffi e Life fazem estudos pelo mundo todo. A África aparece como a área mais afetada e suscetível às doenças fúngicas, principalmente a criptococose (decorrente do fungo Cryptococus neoformans) em consequência da Aids. Há mais de 1 milhão de indivíduos  infectados,  com alta de taxa de mortalidade. “No Brasil, não temos esse número, mas a América Latina é a terceira região com maior ocorrência de criptococose”, diz o médico. Além da Aids, a prática do transplante de órgãos também favorece o surgimento de infecções, pelo fato de que, para não haver rejeição do órgão pelo corpo recipiente, é necessário a aplicação de imunossupressores, diminuindo a imunidade.

O diagnóstico de uma infecção fúngica pode ser feito, de acordo com  Colombo, por quatro métodos diferentes. A forma mais simples é o exame direto da cultura, quando é feita a pesquisa de elementos fúngicos no fluido biológico de um paciente infectado. O segundo método é a biopsia, com a retirada de um fragmento de tecido que se acredita estar contaminado. Outro recurso utilizado é o soro, que pesquisa antígenos de fungo no sangue ou anticorpo específico contra aquele agente. Por fim, há o método PCR (amplificação de ácidos nucléicos para fungo). 

O tratamento, em geral, não é caro, afirma o pesquisador. Drogas como a Anfotericina B,  Fluconazol  e Itraconazol são relativamente baratas, porém não estão disponíveis no Sistema Único de Saúde (SUS). “O investimento para atender aos pacientes e o desenvolvimento em recursos diagnósticos para o tratamento foram quase inexistentes, como fruto da negligência e das doenças fúngicas não estarem no radar da sociedade”, disse. “A nossa batalha é por argumentar junto à sociedade e ao Sistema Único de Saúde, advogar a importância dessas infecções fúngicas, desenvolver estratégias para diagnóstico e tratamento, assim como formar recursos humanos para que hospitais possam fazer um atendimento às populações suscetíveis de forma adequada”, finaliza.

Biotecnologia aplicada

Fotomicrografia de leveduras de Paracoccidioides brasiliensis

Paracoccidioides brasiliensis • termo-dimórfico

Quando aumenta-se a temperatura de 25ºC para 37ºC, o fungo se transforma de micélio para levedura, tornando-se patogênico.

Claudia Campos, professora adjunta do Instituto de Ciência e Tecnologia (ICT) da Unifesp – Campus São José dos Campos, desenvolve uma pesquisa que tem como foco a bioquímica intracelular do fungo, incluindo os processos bioquímicos que controlam a proliferação, a diferenciação e demais características que estão relacionadas a causas de doenças. O projeto “Bioquímica e Sinalização Celular na Biologia do Fungo Paracoccidioides brasiliensis”, financiado pela Faspesp, tem por objetivo conhecer os processos desse fungo com o intuito de, futuramente, desenvolver drogas para o controle de doenças fúngicas.

A escolha do Paracoccidioides brasiliensis deve-se à sua capacidade de realizar diferenciação. Quando se eleva a temperatura de 25ºC para 37ºC, o fungo se transforma de micélio para levedura, tornando-se patogênico. Ele é descrito como termodimórfico: sua mudança de forma depende de um aumento na temperatura. “Vários eventos químicos acontecem em paralelo com a transformação morfológica e esse é o meu interesse, estudar diferenciação em fungos. Como isto está relacionado com a patogênese, para entender o processo é necessário conhecer os mecanismos que controlam a diferenciação”, relatou a pesquisadora. Suas características permitem que as descobertas sobre o seu comportamento sejam estendidas a outros fungos.

A doença causada pelo fungo selecionado, a paracoccidioidomicose é encontrada somente na América Latina. Ela está relacionada com a atividade rural, pois a forma infectante encontra-se no solo. A infecção começa no pulmão, espalhando-se pelas mucosas, podendo causar feridas na boca, nariz ou atingindo a pele, sendo essa a forma mais comum e crônica. A aguda, mais grave e rara, atinge órgãos internos e cai na circulação, dificultando o tratamento. A enfermidade afeta principalmente homens na fase adulta. Quando ocorre em mulheres ou crianças, geralmente, é na forma aguda. “O tempo de tratamento de micoses, de maneira geral, é muito longo”, afirma Claudia. “O óbito não é algo incomum na versão mais severa da doença”.

A enzima calcineurina, um dos alvos da pesquisa, controla a morfogênese, proliferação e a patogenicidade do fungo. O ponto de partida é descrever sua ação e interação com outras enzimas. Ela está presente tanto em células de mamíferos (neurônios e células do sistema imunológico), quanto em fungos, nos quais controla aspectos importantes de sua biologia. “A calcineurina é interessante, pois se há a inibição dela, diversos aspectos relacionados com a patogenicidade do fungo também são inibidos”, afirma Claudia. Existe uma droga contra essa enzima, porém ela não diferencia a calcineurina do hospedeiro (humano) e do fungo. Desse modo é preciso entender como ela age e quais são seus parceiros moleculares, para localizar diferenças e conseguir buscar algo específico para intervir somente na biologia do fungo.

O grupo envolvido nessa pesquisa estuda, também, vias de sinalização celular que interagem com a calcineurina. A célula percebe qualquer sinal que esteja fora dela: nutrientes, glicose, aminoácido, entre outros. Receptores localizados na sua superfície emitem esses sinais para dentro da célula. No caso do Paracoccidioides brasiliensis, o estímulo poderia ser a mudança de temperatura, que ativará alguma molécula na membrana que faz com que entre cálcio, e este impulsionará a calcineurina. “Esta é uma fosfatase, enzima que possui a capacidade de retirar fosforilas (molécula ou átomo de fósforo com hidrogênios ligados, de proteínas), ou seja, se existe um alvo fosforilado, ela tirará essas fosforilas”, explica.

Quando foram comparadas células de uma cultura sem tratamento e outra tratada com o inibidor de calcineurina (ciclosporina A), usando diferentes métodos, foram encontrados diferentes tipos de lipídios. “Isso é uma indicação que a calcineurina, além de controlar a proliferação e a diferenciação, de alguma forma também controla o metabolismo lipídico”, analisa Claudia. Essa fase do projeto obteve financiamento, com a bolsa Jovem Pesquisador, concedida pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), por quatro anos.

A outra fase – relativa à verificação do envolvimento da calcineurina com os processos – demandou um estudo inicial para revelar os genes que tinham expressões alteradas. Por fim, buscar parceiros intracelulares. Ambos os projetos já foram finalizados e fazem parte do programa de Biotecnologia do campus. “Estou agora elaborando uma nova proposta nessa mesma linha. Mesmo que não envolva a calcineurina, todos são projetos relacionados à virulência desse mesmo fungo”, diz. O diferencial do projeto é o fato de atuar em uma área pouco conhecida pela biologia, a bioquímica intracelular de microrganismos. “Existem poucos estudos em relação a isso e é necessário conhecer para poder intervir”, finaliza Claudia.

Forma de levedura do fungo, proteína APE4 e a cápsula polissacarídica.

As imagens de microscopia óptica (em cinza) mostram a forma da levedura C. neoformans. As imagens em verde  e vermelho são provenientes de microscopia de fluorescência e mostram, respectivamente, a proteína APE4  e a cápsula polissacarídica,  as quais são importantes fatores de virulência, isto é, são essenciais para causar a meningite fúngica.

Novos protótipos de antifúngicos

No Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas da Unifesp – Campus Diadema, a pesquisa com doenças fúngicas tem dois eixos bem definidos.

Os professores Renata Pascon e Marcelo Vallim, do Laboratório de Interações Microbianas (LIM), estudam o Cryptoccocus neoformans, que é o agente etiológico da criptococose ou meningite fúngica, uma doença fatal que afeta indivíduos imunocomprometidos. Uma segunda vertente da pesquisa visa buscar novos antifúngicos que possam agir em conjunto com os já existentes. Esse trabalho é desenvolvido de forma integrada com os professores João Henrique Ghilardi Lago e Patrícia Sartorelli, do Laboratório de Química Biorgânica Otto Richard Gottlieb (LABIORG).

No primeiro eixo da pesquisa, o Cryptoccocus neoformans é considerado um modelo biológico por ser a sua manipulação genética extremamente maleável. Os pesquisadores usam as informações sobre o genoma e as ferramentas de biologia molecular deste fungo para construir linhagens geneticamente modificadas, as quais ajudam a conhecer melhor os mecanismos que controlam a virulência e a patogênese. A inativação específica de genes e a análise dos mutantes ajudam a apontar novos alvos moleculares para desenvolvimento de antifúngicos. O LIM possui um bombardeador de partículas, também conhecido como Biolística, para gerar as linhagens geneticamente modificadas para estudo.

De acordo com os pesquisadores, são estudadas as vias metabólicas que levam a biossíntese e aquisição de aminoácidos. Também a capacidade de o Cryptoccocus neoformans aumentar a temperatura fisiológica dos mamíferos. Os aminoácidos são importantes aspectos da biologia dos fungos que possibilitam a invasão do hospedeiro. Os estudiosos já identificaram diversos genes importantes que atuam em processos biológicos, como a via de biossíntese do triptofano e das pirimidinas, transporte intracelular de aminoácidos e autofagia. Os projetos têm financiamento da Fapesp e do CNPq.

No segundo eixo, o trabalho é caracterizado pela ampla interdisciplinaridade do grupo de quatro professores, a qual foi fortalecida com a criação de dois programas de pós-graduação: Biologia Química e Biotecnologia, e da aprovação de projetos de pesquisa com financiamento da Fapesp no âmbito do Programa de Pesquisas em Caracterização, Conservação, Recuperação e Uso Sustentável da Biodiversidade do Estado de São Paulo (BIOTA). A colaboração de pesquisadores da área de Química de Produtos Naturais abriu uma nova vertente: explorar a diversidade da flora brasileira, agregando valor a diferentes espécies vegetais, buscando soluções para a doença que este fungo causa. “Nós queremos saber, por exemplo, como as substâncias naturais oriundas de plantas brasileiras podem atuar na redução ou na inibição do crescimento desses fungos”, diz João Lago. “Por isso, estudamos as vias metabólicas. Sabemos que existem muitos aminoácidos e vitaminas que o fungo consegue sintetizar e a célula animal não. Portanto, se criarmos um medicamento que atue nesse ponto, ele prejudicará apenas o fungo”, afirma Renata Pascon. No caso da bactéria, por ser uma célula procariota (ser vivo unicelular e cujo núcleo não está separado do citoplasma), há uma gama de inibidores de crescimento que podem ser usados.

Para começar a seleção das plantas capazes de inibir o crescimento e a proliferação de fungos, é necessário ter, antes, algum tipo de informação sobre as propriedades da espécie. Na sequência, os extratos e/ou óleos voláteis são preparados e submetidos a diferentes processos cromatográficos e espectrométricos, tais como a CG/EM (cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas), a CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) e a RMN (ressonância magnética nuclear), visando a separação e a identificação molecular das substâncias presentes nas matrizes bioativas.
Algumas espécies vegetais, como Eugenia uniflora e Plinia trunciflora (Myrtaceae), Porcelia macrocarpa (Annonaceae) e Nectandra megapotamica (Lauraceae), forneceram óleos voláteis que contém substâncias com atividade expressiva. “Nós demonstramos, usando a técnica de determinação da CIM (concentração inibitória mínima), qual quantidade dessa substância é capaz de impedir o crescimento do fungo, em comparação com o antifúngico padrão”, explica Vallim. 

O diferencial do projeto é a interdisciplinaridade possibilitada pelo programa de Biologia Química, o primeiro aprovado pela Capes no Campus Diadema. “É um trabalho interdisciplinar que envolve diversas ferramentas biológicas e químicas. Podemos atuar desde a identificação do alvo molecular até o isolamento”, explica João Lago. “Desta forma, é possível desenvolver projetos em áreas distintas, inclusive na Química Medicinal, podendo-se preparar vários protótipos diferentes baseados na estrutura original do produto bioativo”.

Patrícia Sartorelli, Renata Pascon, Marcelo Vallim e João Lago, respectivamente.

Artigos relacionados:
PALAVANI, E. B.; MARIANE, B.; VALLIM, M.A.; PASCON, R.; SARTORELLI, P.; SOARES, M. G.; LAGO, J. H. G.  The seazonal variation of the chemical composition of essential oils from Porcelia macrocarpa R.E. Fries (Annonaceae) and their antimicrobial activity. Molecules, v. 18, n. 11, p. 13574-13587, nov. 2013.

LAGO, J. H. G.; SOUZA, E.D.; MARIANE, B.; PASCON, R.; VALLIM, M. A.; MARTINS, R. C. C.; BAROLI, A. A.; CARVALHO, B. A.; SOARES, M. G.; SANTOS, R. T.; SARTORELLI, P. Chemical and biological evaluation of essential oils from two species of Myrtaceae – Eugenia uniflora L. and Plinia trunciflora (O. Berg) Kausel. Molecules, v. 16, n.12, p. 9827-9837, dez. 2011.

PASCON, Renata C.;  GONTIJO, Fabiano Assis de; FERNANDES, Larissa; MACHADO-Junior, Joel;  ALSPAUGH, J. Andrew; VALLIM, Marcelo A. The role of de novo pyrimidine biosynthetic pathway in Cryptococcus neoformans high temperature growth and virulence. Fungal Genetics and Biology, 2014. Artigo aceito para publicação. 

Bioprospecção de fungos do Zoológico

Lâmina de microscopia de linhagem isolada de Aspergillus sp.

Quem vai ao Zoológico de São Paulo não imagina, mas além de ele possuir um acervo enorme de animais do mundo todo e estar localizado no último resquício de Mata Atlântica da capital, abriga uma grande diversidade de bactérias e fungos. É isso que o médico e professor da EPM, Luiz Juliano, percebeu ao montar um primeiro projeto financiado pela Fapesp, construindo um laboratório de pesquisa naquele espaço. Tal empreendimento teve como objetivo o estudo da microbiologia aplicada, ou seja, a investigação da microbiota, das comunidades microbianas (bactérias, fungos, leveduras) e recursos genéticos como um todo. A professora adjunta do Campus Diadema, Suzan Pantaroto, entrou no grupo de pesquisadores e iniciou o projeto “Potencial biotecnológico de fungos da Fundação Parque Zoológico de São Paulo”, junto com o professor Wagner Luiz Batista, do mesmo campus. Os pesquisadores usam o zoológico como fonte de amostragem da pesquisa.

O principal objetivo da pesquisa é estudar o potencial enzimático dos animais. Uma parte da equipe analisa a função de metabólicos secundários com função antibiótica, principalmente nos fungos. “Nós já detectamos alguns desses microrganismos que produzem compostos com atividade antibiótica de amplo espectro, melhor do que o próprio antibiótico comercial usado como referência”, relata Suzan. Outro estudo envolve a avaliação em biocatálise, que é a produção de blocos de construção. A investigação visa detectar o potencial de produção de celulase e protease voltada a formação de etanol de segunda geração, além da ação de biorregulação em ambientes contaminados por petróleo, efluentes industriais ricos em hidrocarboneto. Essa parte do trabalho está sendo feita por André Luiz Meleiro Porto, da USP – São Carlos.   

Processo de compostagem

À esquerda, revirada do material orgânico após 60 dias na cela de compostagem. À direita, coleta de amostragens da célula de compostagem dos resíduos orgânicos de hipopótamo.

À esquerda, trado utilizado para coleta do material. À direita, material coletado e homogeneizado.

Pilha de resíduos orgânicos

Todos esses estudos utilizam a mesma fonte: a compostagem de material orgânico do zoológico (restos de poda, folhas podres ou árvores que caem). O material é levado à unidade de produção onde é triturado e transformado em composto orgânico. A célula de compostagem é montada com uma camada de folhagem e uma de fezes (resíduos de alimentos dos bichos). A temperatura é elevada até 80ºC, sendo necessário irrigar e revolver essa pilha, que virará biofertilizante rico em microrganismos.

Para isolar um fungo, os pesquisadores selecionam uma amostra de mais ou menos 100 gramas, cuja composição é estabelecida por técnicos, incluindo veterinários. “Feito isso, levo a amostra ao laboratório e faço o plaqueamento em diferentes meios de cultura que permitam o crescimento de fungos”, descreve a pesquisadora. Em seguida aplica-se antibiótico, para que só obtenha fungos. Se a comunidade isolada apresentar atividade interessante, realiza-se uma caracterização taxonômica.

A bioprospecção de fungos é muito importante. “A investigação do potencial de aplicação desses fungos contempla também o uso positivo, não apenas o lado infeccioso”, afirma Suzan. Uma vez isolado, o fungo pode ser induzido, se ele possuir essa capacidade, a fornecer algo que está sendo buscado. Isso se chama rota metabólica.

“O diferencial do projeto é a fonte de amostragem, o zoológico. Além de termos a possibilidade de trabalhar com uma amostra única, que é a compostagem e todo acervo animal”, disse. “Essa parceria, Unifesp e zoológico, deu muito certo. Nós como grupo de pesquisa e eles como interessados em ajudar e fornecer amostras, podendo até chegar à patente de um produto”, completa Suzan.